日機(jī)裝株式會(huì)社、日本勃林格殷格翰株式會(huì)社與?澤?學(xué)醫(yī)藥保健研究域藥學(xué)系的?井 郁?教授等人的研究組，成功研發(fā)了具有正常培養(yǎng)條件下無(wú)法觀察到的腎臟功能的創(chuàng)新藥物研究用人腎細(xì)胞『3D-RPTEC』。新開發(fā)的技術(shù)有望在創(chuàng)藥研究領(lǐng)域中代替過(guò)去主要通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)測(cè)試藥物的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，并且為提高新藥開發(fā)的效率做出貢獻(xiàn)。
本研究結(jié)果已在2023年6?29?科學(xué)志『 Drug Metabolism and Disposition 』 （https://dmd.aspetjournals.org/content/early/2023/06/29/dmd.122.001171）刊登。
創(chuàng)藥研究用人腎細(xì)胞，是通過(guò)用特殊的培養(yǎng)方法培養(yǎng)市售的人腎由來(lái)細(xì)胞，再現(xiàn)了至今為止難以觀察到的腎臟功能，實(shí)際已經(jīng)確認(rèn)其具備約20種主要藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體※ 的機(jī)能。
在創(chuàng)藥研究中，藥物的評(píng)價(jià)（藥物動(dòng)態(tài)和毒性）主要是通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的， 然而從物種差異和愛護(hù)動(dòng)物的角度出發(fā)，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)代替動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在“試驗(yàn)管內(nèi)（＝in vitro）”重現(xiàn)并進(jìn)行評(píng)估是需求所向。由于評(píng)估是基于人類來(lái)源的腎細(xì)胞而非動(dòng)物，除了能消除物種差異的問(wèn)題，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)比動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可以更快地從研發(fā)初期階段獲得數(shù)據(jù)，從而縮減藥物研發(fā)時(shí)間和成本。然而，一直以來(lái)都沒(méi)有能滿足創(chuàng)藥研究需求的人腎細(xì)胞。
與活體腎臟相比，傳統(tǒng)的人腎細(xì)胞（HK-2細(xì)胞和初代近端小管上皮細(xì)胞）在通常的培養(yǎng)條件下會(huì)喪失許多腎臟特有的機(jī)能(Jenkinson et al., Eur J Physiol, 2012) 。因此，在創(chuàng)藥研究時(shí)，很多情況下會(huì)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)腎臟進(jìn)行評(píng)估。本次研究中，將在平面培養(yǎng)中無(wú)法顯現(xiàn)的人近端小管上皮細(xì)胞（RPTEC）的OAT1（有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1）的遺傳基因作為指標(biāo)，研究了培養(yǎng)條件，嘗試改善了RPTEC的腎臟機(jī)能。制造球狀細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱3D-RPTEC) ，并在?定條件下經(jīng)三維培養(yǎng)后，OAT1遺傳基因顯現(xiàn)量隨培養(yǎng)天數(shù)上升，與人腎?質(zhì)的mRNA顯現(xiàn)量有相同程度的改善（圖1）。對(duì)本細(xì)胞實(shí)施微陣列的網(wǎng)羅性遺傳基因表達(dá)解析和蛋白質(zhì)組學(xué)的網(wǎng)羅性蛋白質(zhì)表達(dá)解析的結(jié)果表明，除OAT1外，監(jiān)管部門評(píng)估所需的SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體，比起平面培養(yǎng)，通過(guò)三維培養(yǎng)得到了改善，甚至在培養(yǎng)32天后仍能保持顯現(xiàn)（圖2）。
此外，在對(duì)來(lái)自三個(gè)不同供體的RPTEC進(jìn)行三維培養(yǎng)的mRNA顯現(xiàn)分析中，約17000個(gè)基因中有87%的基因僅有50%的CV%變異，表明3D-RPTEC是一種供體差異小，易于使用的細(xì)胞。作為藥物評(píng)估的例子，實(shí)施了以細(xì)胞內(nèi)ATP量（生存率）為指標(biāo)的in vitro毒性試驗(yàn)。結(jié)果表明，顯示藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體引起腎毒性的Cisplatin和Adefovir，濃度依賴性地使細(xì)胞內(nèi)ATP量減少。其減少分別被OCT（有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體）的抑制劑Cimetidine、OAT（有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體）的抑制劑Probenecid所抑制（圖3）。因此表明，3D-RPTEC在醫(yī)藥品開發(fā)中的藥物動(dòng)態(tài)和毒性評(píng)估中，是一種簡(jiǎn)便且高效的in vitro實(shí)驗(yàn)系列。
概括而言，通過(guò)RPTEC制造球狀細(xì)胞，在一定條件下三維培養(yǎng)的具備腎臟主要功能之一的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體與人腎臟的顯現(xiàn)量相同，并可長(zhǎng)期維持28天以上（專利第6995112號(hào)）。另外，3D-RPTEC 還可用于觀察藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體引起的腎毒性。而且，不僅是藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體，蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)到的約4800種蛋白質(zhì)中有90%的顯現(xiàn)量與人腎臟中的顯現(xiàn)量水平相同，這表明3D-RPTEC在醫(yī)藥品開發(fā)中的藥物動(dòng)態(tài)和毒性評(píng)估中，是一種簡(jiǎn)便且高效的in vitro實(shí)驗(yàn)系列。另外，不僅是創(chuàng)藥研究，這種人類腎臟細(xì)胞還有望用于各種與腎臟有關(guān)的研究中。
在3D-RPTEC中（左圖）OAT1遺傳基因的顯現(xiàn)量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加，并在培養(yǎng)10天后達(dá)到最大值。
上述照片（右圖）由日機(jī)裝拍攝。
顯示常規(guī)平面培養(yǎng)中RPTEC的遺傳基因質(zhì)顯現(xiàn)量（A）和3D-RPTEC中的遺傳基因顯現(xiàn)量（B）。與常規(guī)平面培養(yǎng)相比，3D-RPTEC中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的顯現(xiàn)量得到了改善，并且能夠確定顯現(xiàn)量從培養(yǎng)的第12天一直維持到第32天。
顯示了在3D-RPTEC中暴露Cisplatin時(shí)細(xì)胞內(nèi)ATP量（A）與暴露Adefovir時(shí)細(xì)胞內(nèi)ATP量（B）。使用OCT及OAT的抑制劑，結(jié)果表明3D-RPTEC可檢測(cè)出藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體引起的毒性。
根據(jù)本研究成果，?機(jī)裝株式會(huì)社將創(chuàng)藥研究用人腎細(xì)胞『3D-RPTEC?』產(chǎn)品化，于2023年7月開始正式銷售。
今后，將3D-RPTEC作為腎臟評(píng)估的工具，在實(shí)驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng)廣泛應(yīng)用，努力實(shí)現(xiàn)利用人腎細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化。
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