日機裝株式會社

日本勃林格殷格翰株式會社

金澤大學

日機裝株式會社、日本勃林格殷格翰株式會社與?澤?學醫(yī)藥保健研究域藥學系的?井 郁?教授等人的研究組，成功研發(fā)了具有正常培養(yǎng)條件下無法觀察到的腎臟功能的創(chuàng)新藥物研究用人腎細胞『3D-RPTEC』。新開發(fā)的技術有望在創(chuàng)藥研究領域中代替過去主要通過動物實驗測試藥物的細胞實驗，并且為提高新藥開發(fā)的效率做出貢獻。

本研究結果已在2023年6?29?科學志『 Drug Metabolism and Disposition 』 （https://dmd.aspetjournals.org/content/early/2023/06/29/dmd.122.001171）刊登。

創(chuàng)藥研究用人腎細胞，是通過用特殊的培養(yǎng)方法培養(yǎng)市售的人腎由來細胞，再現(xiàn)了至今為止難以觀察到的腎臟功能，實際已經確認其具備約20種主要藥物轉運體^※ 的機能。

在創(chuàng)藥研究中，藥物的評價（藥物動態(tài)和毒性）主要是通過動物實驗進行的， 然而從物種差異和愛護動物的角度出發(fā)，通過細胞實驗代替動物實驗，在“試驗管內（＝in vitro）”重現(xiàn)并進行評估是需求所向。由于評估是基于人類來源的腎細胞而非動物，除了能消除物種差異的問題，細胞實驗比動物實驗可以更快地從研發(fā)初期階段獲得數據，從而縮減藥物研發(fā)時間和成本。然而，一直以來都沒有能滿足創(chuàng)藥研究需求的人腎細胞。

與活體腎臟相比，傳統(tǒng)的人腎細胞（HK-2細胞和初代近端小管上皮細胞）在通常的培養(yǎng)條件下會喪失許多腎臟特有的機能(Jenkinson et al., Eur J Physiol, 2012) 。因此，在創(chuàng)藥研究時，很多情況下會通過動物實驗對腎臟進行評估。本次研究中，將在平面培養(yǎng)中無法顯現(xiàn)的人近端小管上皮細胞（RPTEC）的OAT1（有機陰離子轉運蛋白1）的遺傳基因作為指標，研究了培養(yǎng)條件，嘗試改善了RPTEC的腎臟機能。制造球狀細胞(以下簡稱3D-RPTEC) ，并在?定條件下經三維培養(yǎng)后，OAT1遺傳基因顯現(xiàn)量隨培養(yǎng)天數上升，與人腎?質的mRNA顯現(xiàn)量有相同程度的改善（圖1）。對本細胞實施微陣列的網羅性遺傳基因表達解析和蛋白質組學的網羅性蛋白質表達解析的結果表明，除OAT1外，監(jiān)管部門評估所需的SLC轉運體，比起平面培養(yǎng)，通過三維培養(yǎng)得到了改善，甚至在培養(yǎng)32天后仍能保持顯現(xiàn)（圖2）。

此外，在對來自三個不同供體的RPTEC進行三維培養(yǎng)的mRNA顯現(xiàn)分析中，約17000個基因中有87%的基因僅有50%的CV%變異，表明3D-RPTEC是一種供體差異小，易于使用的細胞。作為藥物評估的例子，實施了以細胞內ATP量（生存率）為指標的in vitro毒性試驗。結果表明，顯示藥物轉運體引起腎毒性的Cisplatin和Adefovir，濃度依賴性地使細胞內ATP量減少。其減少分別被OCT（有機陽離子轉運體）的抑制劑Cimetidine、OAT（有機陰離子轉運體）的抑制劑Probenecid所抑制（圖3）。因此表明，3D-RPTEC在醫(yī)藥品開發(fā)中的藥物動態(tài)和毒性評估中，是一種簡便且高效的in vitro實驗系列。

概括而言，通過RPTEC制造球狀細胞，在一定條件下三維培養(yǎng)的具備腎臟主要功能之一的藥物轉運體與人腎臟的顯現(xiàn)量相同，并可長期維持28天以上（專利第6995112號）。另外，3D-RPTEC 還可用于觀察藥物轉運體引起的腎毒性。而且，不僅是藥物轉運體，蛋白質組學檢測到的約4800種蛋白質中有90%的顯現(xiàn)量與人腎臟中的顯現(xiàn)量水平相同，這表明3D-RPTEC在醫(yī)藥品開發(fā)中的藥物動態(tài)和毒性評估中，是一種簡便且高效的in vitro實驗系列。另外，不僅是創(chuàng)藥研究，這種人類腎臟細胞還有望用于各種與腎臟有關的研究中。

在3D-RPTEC中（左圖）OAT1遺傳基因的顯現(xiàn)量隨著培養(yǎng)天數的增加而增加，并在培養(yǎng)10天后達到最大值。

上述照片（右圖）由日機裝拍攝。

顯示常規(guī)平面培養(yǎng)中RPTEC的遺傳基因質顯現(xiàn)量（A）和3D-RPTEC中的遺傳基因顯現(xiàn)量（B）。與常規(guī)平面培養(yǎng)相比，3D-RPTEC中藥物轉運體的顯現(xiàn)量得到了改善，并且能夠確定顯現(xiàn)量從培養(yǎng)的第12天一直維持到第32天。

顯示了在3D-RPTEC中暴露Cisplatin時細胞內ATP量（A）與暴露Adefovir時細胞內ATP量（B）。使用OCT及OAT的抑制劑，結果表明3D-RPTEC可檢測出藥物轉運體引起的毒性。

根據本研究成果，?機裝株式會社將創(chuàng)藥研究用人腎細胞『3D-RPTEC^?』產品化，于2023年7月開始正式銷售。

今后，將3D-RPTEC作為腎臟評估的工具，在實驗現(xiàn)場廣泛應用，努力實現(xiàn)利用人腎細胞進行細胞實驗的標準化。